Лекарственные средства модифицированных нуклеиновых оснований

Что такое ДНК-вакцины и с чем их едят?

Автор

Редактор

ДНК-вакцины относятся к типу принципиально новых биологических препаратов. С их разработкой связывают большие надежды на повышение эффективности профилактики не только заболеваний бактериальной, вирусной и паразитарной природы, но и аллергических, аутоиммунных и даже онкологических болезней. Более двадцати лет назад возникла идея использовать гены возбудителей заболеваний для активации защитных механизмов. Конструкция ДНК-вакцин гениально проста: главные компоненты в ней — вектор и целевой иммуноген. Но, несмотря на это, ДНК-вакцины не стоят на страже нашего здоровья: их не вводят пациентам в поликлиниках, они не продаются в аптеках.

Более сотни лет прошло с введения Л. Пастером термина «вакцина» (лат. vacca — корова) и более двух сотен — с легендарных экспериментов Э. Дженнера по прививанию коровьей оспы ребенку с целью предупреждения развития опасного человеческого варианта болезни. Принцип защитного действия введенных в организм ослабленных инфекционных агентов или их частей научным языком объяснили уже в XX веке: безопасный чужеродный антиген учит иммунную систему в дальнейшем быстро распознавать и уничтожать активного и опасного возбудителя с точно такими же антигенами*. Процесс часто сравнивают с раздачей фоторобота преступника сотрудникам полиции.

* — Хронологию разработки вакцин, информацию о влиянии вакцинации на характер эпидемий и численность человечества, доводы адептов движения антивакцинации и ответы на множество животрепещущих вопросов относительно целесообразности, пользы и вреда прививок можно найти в статье «Вакцины в вопросах и ответах» [1]. — Ред.

За 200 лет форма и содержание прививок претерпели существенные изменения: Дженнер инфицировал царапины содержимым оспинных пустул, Пастер облагородил процедуру, вводя ослабленных агентов шприцем, затем научились создавать вакцины из убитых и даже растерзанных возбудителей (сплит- и субъединичные вакцины), недавно начали использовать рекомбинантные вакцины, содержащие один или несколько антигенов (обычно белковых), синтезированных генно-инженерным путем. И вот в двери ВОЗ робко стучится новый плод, порожденный слиянием науки с фарминдустрией, — вакцина из нуклеиновых кислот [2].

Начало ДНК-вакцинологии связывают с работами Д. Танга (1992 г.), в которых была показана способность плазмидной ДНК, экспрессирующей гормон роста человека, индуцировать выработку антител.

В классическом варианте такие вакцины состоят из плазмидных ДНК, содержащих гены возбудителей инфекционных заболеваний (целевые гены, или иммуногены). Продукты данных генов способны вызывать развитие защитных реакций организма, выступая в этом случае в роли антигенов. Доставку ДНК в макроорганизм первоначально осуществляли в комплексе с катионными липидами, однако эффект от введения препарата чистой нуклеиновой кислоты оказался более выраженным. Введенная в организм ДНК проникает в клеточное ядро, превращая клетку в завод по производству вакцины. Такая ДНК длительное время существует вне хромосом без репликации, транскрибируется за счет ферментов хозяйской клетки и экспрессирует соответствующие гены, продукты которых вызывают формирование иммунитета (рис. 1).

Рисунок 1. Схематическое изображение процессов в клетке после проникновения ДНК-вакцины. Рисунок из «Википедии».

ДНК-вакцины сохраняются в организме 3–4 недели. За это время они успевают индуцировать Т- и В-клеточный иммунитет (рис. 2). Однако, несмотря на кажущуюся простоту, многие механизмы развития иммунного ответа на ДНК-вакцины остаются малоизученными [3].

Рисунок 2. Схема развития иммунного ответа на ДНК-вакцину. Рисунок из «Википедии».

Более чем 20-летняя эволюция ДНК-вакцин продолжается и сегодня. Прогресс в дизайне кодирующих антигены нуклеотидных последовательностей, в оптимизации состава (в том числе включение молекулярных адъювантов), в совершенствовании форм и физических методов доставки позволил второму поколению ДНК-вакцин преодолеть такие проблемы первого поколения, как низкий уровень трансфекции и недостаточная иммуногенность.

Сейчас разработки в области генетических вакцин проводятся во многих странах мира. В настоящее время сконструированы экспериментальные ДНК-вакцины для профилактики инфекционных заболеваний паразитарной (шистосомоз, лейшманиоз), бактериальной (хламидиоз, сибирская язва, микоплазмозы) и вирусной (бешенство, лихорадки Западного Нила и Эбола) природы. На разных стадиях доклинических и клинических испытаний находятся генетические вакцины против вирусов гриппа, гепатитов А и В, герпеса, кори, геморрагических лихорадок, ВИЧ, собачьей чумы, ящура, папилломавирусов, цитомегаловирусов. Столь интенсивное развитие данного направления вакцинологии, вероятно, уже в ближайшей перспективе обеспечит реальный выход в виде эффективных и безопасных вакцинных препаратов, рекомендованных для применения в здравоохранении и ветеринарии.

Чем же ДНК-вакцины хороши?

• индуцируют гуморальный (образование антител) и клеточный (активация цитотоксических Т-лимфоцитов) иммунные ответы;
• активируют систему интерферонов;
• могут избирательно воздействовать на различные субпопуляции лимфоцитов. Принципиально возможна разработка ДНК-вакцин, которые избирательно активируют разные типы Т-хелперных лимфоцитов. Благодаря этому могут быть созданы генные вакцины для лечения лиц с аутоиммунными или аллергическими заболеваниями, патогенез которых связан с нарушением различных звеньев иммунной регуляции;
• способствуют формированию длительного иммунитета;
• отсутствует присущий живым вакцинам риск реверсии вирулентности;
• могут производить одновременно несколько антигенов;
• обладают широкими возможностями модификации (сайт-специфический мутагенез, включение различных регуляторных последовательностей);
• отличаются высокой стабильностью. Они способны выдерживать низкие и высокие температуры (немногим ниже температуры кипения воды) и разные условия влажности. Поэтому ДНК-вакцины не требуют организации «холодовых цепочек» (комплекса мероприятий, обеспечивающих хранение вакцин в холодильных установках на всем пути от места производства до конечного потребителя). Таким образом, стоимость транспортировки и хранения ДНК-вакцин значительно ниже.

Но. всё хорошее имеет свои недостатки

• более низкая по сравнению с живыми вакцинами эффективность, особенно по отношению к крупным млекопитающим и человеку, и потому необходимость многократной иммунизации;
• отсутствие эффективной доставки в антигенпрезентирующие клетки;
• формирование иммунитета только в отношении протеиновых компонентов болезнетворных микроорганизмов, поскольку целевые гены кодируют белки. ДНК-вакцины не могут заменить препараты, действие которых основано на использовании антигенных молекул другой природы, например капсульных антигенов, представленных полисахаридами (полисахаридные пневмококковые, менингококковые, брюшнотифозные вакцины и др.);
• вероятность атипического процессинга и биохимических изменений (например, гликозилирования) антигенов в эукариотических клетках;
• возможность ослабления иммунного ответа на целевой антиген из-за иммуногенности вирусных компонентов (при использовании вирусных систем доставки);
• отсутствие данных о безопасности таких вакцин, т.к. не изучены последствия, к которым приводит длительная экспрессия в макроорганизме чужеродной генетической информации;
• возможность развития нежелательных иммунологических реакций в виде хронических воспалительных процессов или генерализованной иммуносупрессии из-за пролонгированной экспрессии антигена в макроорганизме.

Конструкция ДНК-вакцин

Для получения ДНК-вакцин ген, кодирующий продукцию иммуногенного белка, необходимо встроить в вектор, роль которого выполняют бактериальная плазмида или вирус [4]. Вектор не должен реплицироваться в клетках макроорганизма, поэтому может содержать только прокариотические сайты инициации репликации.

Для создания ДНК-вакцин используются хорошо изученные плазмиды грамотрицательных бактерий (в основном E. coli), в частности многокопийная pUC19 или pBR322 и их производные. Разработаны специальные векторы для ДНК-вакцин — pcDNA3 и pcDNA3.1 (Invitrogen), которые содержат цитомегаловирусный (ЦМВ) промотор и сигнал полиаденилирования гена гормона роста быка. Также к коммерчески доступным плазмидам, которые чаще всего используются в качестве векторов для ДНК-вакцин, относятся: pVAX1 (Invitrogen), pCI, VR1012 DNA, pJW4303, pVAC1-mcs и pVAC2-mcs (InvivoGen). Последние две применяются для усиления гуморального иммунного ответа и содержат антигены к поверхностным структурам мышечных клеток [5].

Из числа вирусных векторов, обеспечивающих более высокий уровень экспрессии целевого антигена, чаще всего используются: дефектный по репликации аденовирус серотипа 5 (AD5), ортопоксвирусы и модифицированные вирусы осповакцины, альфавирусы. Аденовирусный вектор обладает высокой эффективностью трансфекции — до 100 %, в него можно включать до 8 т.п.н. ДНК. Отрицательный момент — синтез собственных белков, способных индуцировать иммунный ответ. Самые используемые осповакцинные модификации — Ankara (MVA) и New York Vaccinia strain (NYVAC). Первая получена в результате 56-кратного пассирования вируса в куриных эмбриональных фибробластах. В геноме NYVAC удалено 18 открытых рамок считывания, ассоциированных с диапазоном хозяев и вирулентностью. В каждый из перечисленных векторов можно встроить до 50 т.п.н. ДНК [6].

Элементы конструктора

Рисунок 3. Конструкция ДНК-вакцины на основе вектора pVAX1 с химерным геном (Rat cDNA, Human cDNA). Pcmv — цитомегаловирусный промотор; MCS — сайт для множественного клонирования генов; BGH pA — терминатор с сигналом полиаденилирования гена гормона роста быка; Kanamycin — ген устойчивости к канамицину; pUC ori — участок начала репликации плазмид группы pUC; HindIII, BstEII, XbaI — сайты рестрикции. Рисунок из [5].

Чтобы пригодиться для создания ДНК-вакцин, каждый уважающий себя вектор должен содержать необходимые конструкционные элементы (рис. 3).

• Структуры, обеспечивающие репликацию плазмиды (используются ori pUC19, pMB1), и сайты рестрикции.
• Селективные маркеры: гены устойчивости к антибиотикам (но не к пенициллину и другим β-лактамным антибиотикам) [5].
• СpG-мотивы бактерий, которые из-за отсутствия метилирования способны усиливать иммунную реакцию. Данный принцип лежит в основе разработки универсальной вакцины и подразумевает использование не генов, кодирующих белки-антигены микробов, а бактериальных последовательностей CG в качестве активного компонента вакцины [7].
• Последовательность Козак — консенсусная последовательность, окружающая старт-кодон (GCC(A/G)CCAUGG), которая играет важную роль в инициации трансляции у эукариот.
• Промотор для экспрессии целевого гена в клетках эукариот. Наиболее часто используют промоторы вируса SV40, цитомегаловируса (часто вместе с интроном А), промотор бета-актина, промоторы, специфичные для определенных видов ткани (например, промотор гена десмина для экспрессии в миоцитах, промотор гена гидроксилазы витамина D₃ — в кератиноцитах, альбуминовый — в гепатоцитах). Применение промотора и системы синтеза бактериофага Т7 позволяет осуществлять экспрессию целевого гена без участия транскрипционной системы клеток макроорганизма и, соответственно, без перемещения вектора в ядро [8].
• Целевой ген, кодирующий белок патогена. Он также может содержать дополнительные нуклеотидные последовательности, кодирующие лиганды для рецепторов антигенпредставляющих клеток. Такими последовательностями могут выступать гены маркерного белка CD40, внеклеточного домена Fms-подобной тирозинкиназы-3 или антигена-4 Т-киллеров. Облегчение деградации антигена в протеасоме или лизосоме также будет стимулировать иммунную реакцию. Поэтому для усиления протеолитического расщепления антигена в его последовательность встраивают сигнал убиквитинирования [9, 10].
• После целевого гена следуют сигналы полиаденилирования, например, вируса SV40, гена β-глобина кролика или гормона роста быка.
• Замыкают эту цепочку стоп-кодоны, причем часто используются двойные или тройные терминирующие последовательности (TAGTGATGA).

Службы доставки

Способам введения ДНК-вакцин в организм уделяется не меньше внимания, чем созданию самих конструкций, так как от этого зависит успех иммунизации в целом. Поэтому разработаны различные, порой весьма хитроумные, методы доставки таких вакцин в организм.

Рисунок 4. Одноразовый генный пистолет компании PowderJect. а — внешний вид; б — в разрезе. Рисунок с сайта www.apteka.ua.

Самый простой — это парентеральный способ введения, который заключается в инъекции ДНК-вакцин в солевом растворе (внутримышечно, внутрикожно). При этом бόльшая часть ДНК поступает в межклеточное пространство и только потом включается в клетки.

Использование генного пистолета. Для этого ДНК фиксируют на микроскопических золотых гранулах (около 1–2 мкм), а затем с помощью устройства, приводимого в действие сжатым гелием, гранулы «выстреливают» непосредственно внутрь клеток (рис. 4). Для данного способа доставки требуется значительно меньшее количество вводимого материала, чем для внутримышечной инъекции. Так, для инъекции мышам нужно 10-100 мкг препарата, а с использованием генного пистолета достаточно 0,1-1 мкг.

Электропорация — техника, которая с использованием электрических импульсов позволяет формировать поры в клеточной мембране и доставлять ДНК непосредственно в клетки.

Микроконтейнеры из полиматериалов. Московские ученые, например, создали пористую микросферу из карбоната кальция, покрытую несколькими слоями полисахаридов, в которую упаковывается молекула ДНК. Если микросферы в полимерной оболочке поместить в подкисленный раствор, карбонат кальция внутри растворится и уйдет через полимерную мембрану. Внутри останется только ДНК, подлежащая транспортировке. Подобных микроконтейнеров для доставки ДНК разработано не так много. Есть зарубежные аналоги, в которых оболочка капсулы выполнена из полимолочной кислоты. На их основе создают вакцины против гепатита и даже СПИДа. Средний диаметр микрокапсул для доставки ДНК-вакцин всего 1–2 микрона. Такие микрокапсулы можно ввести подкожно или даже в кровь. Если в микрочастицу вместе с ДНК или лекарством поместить фермент, расщепляющий оболочку капсулы изнутри, то высвобождением лекарства можно управлять: чем меньше фермента, тем медленнее рушится оболочка.

Липосомные носители обеспечивают высокую эффективность доставки при внутривенном введении, при этом экспрессия целевых генов значительно возрастает, так как осуществляется во многих органах, и особенно в селезенке.

ДНК-вакцины можно вводить перорально с использованием бактериальных носителей. Для этих целей применяются, например, модифицированные бактерии Shigella flexneri с делецией в гене asd. Мутантные бактерии растут in vitro на среде с диаминопимелиновой кислотой и, проникая в эукариотические клетки, не размножаются в них, так как отсутствует упомянутая кислота, а продуцируют закодированные в плазмиде антигены [6]. Для перорального введения создан вектор на основе ослабленного штамма Salmonella, который способен к самоуничтожению в организме через определенный период времени после выполнения иммунизационных задач. Для этого бактерию модифицировали таким образом, что ее выживание стало зависеть от наличия искусственных сахаров, не встречающихся в условиях организма. После того как в клетках, зараженных генно-инженерным штаммом Salmonella, заканчивается запас специфического сахара, поставляемого вместе с вакциной, бактерии не способны сохранить целостность своих клеточных стенок, что приводит к их гибели [11].

Была предложена оригинальная система доставки ДНК с помощью «теней» — неживых клеток грамотрицательных бактерий, лишенных цитоплазматического содержимого, но сохраняющих морфологию и антигенные структуры, включая адгезивные факторы. «Тени» обладают тропностью к антигенпрезентирующим клеткам макроорганизма и адъювантными свойствами, усиливающими иммунный ответ. Кроме того, в лиофильно-высушенном состоянии препараты «теней» хранятся при комнатной температуре неопределенно долгое время, а их производство дешево [6].

Разработана технология доставки ДНК-вакцин с использованием бактериофагов [12]. В данном случае вакцинная ДНК встраивается в геном вектора-бактериофага, которым затем иммунизируют макроорганизм [13].

Нужно учитывать, что разные методы доставки ДНК-вакцин в организм обеспечивают развитие различных клеточных реакций, при этом важные иммунологические пути могут быть стимулированы или, наоборот, не задействованы в ходе развития защитного ответа. Способы и места введения ДНК-вакцин варьируют для разных видов организмов. Например, уши свиньи — отличное место для инъекций, а вот введение препарата в уши овец или коров неэффективно.

Помощники генетических вакцин

Для усиления иммунного ответа, вызванного ДНК-вакцинами, совместно с ними вводят различные адъюванты, например, плазмиды, кодирующие синтез цитокинов, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора и других костимуляторных молекул (B7.1 (CD80), B7.2 (CD86) и CD40) [14].

Для ДНК-вакцины против ВИЧ создана конструкция, которая обеспечивает получение более высокого титра антител и его сохранность в течение более длительного времени по сравнению с обычной ДНК-вакциной. Эта молекулярная вирусоподобная конструкция представляет собой частицы диаметром 25-30 нм, содержащие в центре полинуклеотидный комплекс — рекомбинантную плазмиду pGEX-2T-TBI с генами инфекционного агента ВИЧ-1 или двухцепочечную РНК, которая является стимулятором неспецифической резистентности организма. На поверхности конструкции располагаются гибридные белки, содержащие эпитопы ВИЧ-1 и фермент (например, глутатион-S-трансферазу или галактозидазу). Связь между полинуклеотидным комплексом и гибридными белками осуществляется посредством конъюгата: спермидин (для связи конъюгата с полинуклеотидным комплексом) — полиглюкин — субстрат для фермента (например, глутатион или галактопиранозид; для аффинной сорбции гибридных белков на конструкцию).

Современное состояние ДНК-вакцинологии

В настоящее время в разработке находится около 420 ДНК-вакцин против заболеваний различной этиологии как человека, так и животных.

Бόльшая часть разрабатываемых противоинфекционных терапевтических ДНК-вакцин нацелена на ВИЧ-1. Существенные успехи достигнуты в активной иммунизации против вируса папилломы человека. Некоторые вакцины находятся на стадии клинических испытаний и, возможно, в скором времени будут введены в обязательную практику. Так, американская компания Inovio, специализирующаяся на разработке ДНК-вакцин, создала препарат против цервикальной дисплазии VGX-3100, который проходит вторую фазу клинических испытаний. В 2013 г. VGX-3100 удостоилась награды «Лучшая терапевтическая вакцина» на Всемирном конгрессе по вакцинам. В I или IIа фазах клинических испытаний находятся: вакцины против гепатита С, цервикального рака, рака головы и шеи, СПИДа, гриппа. Компанией Inovio также ведется активная разработка вакцин против лихорадки Эбола* и рака простаты.

* — О более привычном, но не менее перспективном методе борьбы с вирусом Эбола — с помощью «коктейля» из моноклональных антител — читайте в статье «Вирус Эбола и макак-резус: получено новое эффективное лекарство» [15]. — Ред.

Разработке способов вакцинотерапии онкологических заболеваний при помощи рекомбинантных ДНК большое внимание уделяют и другие организации. Хорошую эффективность показала ДНК-вакцина против лейкемии, созданная в Саутгемптонском университете (но вводимая с помощью электропоратора всё той же Inovio). Вакцина направлена на подавление в организме активности гена WT1 (Wilms tumor gene). Именно повышенная активность этого гена отмечается в опухолевых клетках различных видов. В ходе I фазы клинических испытаний у пациентов наблюдалось развитие иммунного ответа, в том числе активация Т-киллеров и выработка антител; была также доказана безопасность новой вакцины. Испытания перешли в фазу II, однако из-за проблем с финансированием организаторы пока не могут увеличить число участников [16].

Животные нуждаются в такой же защите, как и люди. В связи с этим для ветеринарии разрабатываются ДНК-вакцины против бычьего и лошадиного герпесвирусов, собачьего вируса чумы, вируса классической свиной лихорадки, кроличьей папилломы, ящура, вируса инфекционного гемопоэтического некроза, вируса гриппа, вируса японского энцефалита, вируса бешенства, вируса везикулярного стоматита и т.д. [13]. Много ДНК-вакцин создается для борьбы с вирусными, бактериальными и эукариотическими патогенами рыб [17].

Активно разрабатываются ДНК-вакцины для повышения иммунитета птиц. Многокомпонентные ДНК-вакцины могут сократить количество прививок, необходимых во время короткой жизни птиц и позволят избежать риска увеличения вирулентности некоторых патогенов. В случае птицеводства проблема связана с тем, что вакцины вводятся в амниотическую жидкость яиц, которая обладает ДНКазной активностью, поэтому свойства ДНК-вакцины могут ухудшиться. Заключение ДНК в катионные липосомы, скорее всего, поможет решить эту проблему.

Из множества разработанных ДНК-вакцин на сегодняшний день лицензировано всего несколько, причем повезло в этом плане только животным (табл. 1).

Источник